大鼠肝微粒體作為體外代謝研究的核心工具，廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、毒理評估等領(lǐng)域。其富含的細胞色素P450酶系統(tǒng)雖功能強大，但活性易受環(huán)境影響。若操作不當，易導致實驗數(shù)據(jù)偏差甚至失敗。掌握
大鼠肝微粒體在使用中的關(guān)鍵注意事項，是確保實驗結(jié)果可靠、重現(xiàn)性高的前提。
一、規(guī)范儲存，守護酶活性
大鼠肝微粒體對溫度敏感，應(yīng)始終保存在-80℃超低溫環(huán)境中，避免反復凍融。反復解凍會導致酶蛋白變性、活性顯著下降。建議將原液分裝成小份（如50-100μL/管），每次實驗取用一支，解凍后立即使用，嚴禁再次冷凍。
二、精確配制，確保反應(yīng)體系穩(wěn)定
使用前需將微粒體懸液在冰上緩慢解凍，輕柔渦旋混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生氣泡導致蛋白失活。反應(yīng)體系中微粒體蛋白濃度需精確控制（通常0.1-1.0mg/mL），過高會非特異性結(jié)合底物，過低則代謝信號弱。建議使用預冷的緩沖液（如磷酸鹽緩沖液，pH7.4）稀釋。
三、優(yōu)化反應(yīng)條件，模擬生理環(huán)境
代謝反應(yīng)需在37℃水浴或溫控搖床中進行，確保溫度恒定。啟動反應(yīng)前，先將微粒體、緩沖液和底物預溫育2-3分鐘，再加入NADPH再生系統(tǒng)（提供還原當量）啟動反應(yīng)。NADPH為關(guān)鍵輔因子，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，避免光照和長時間暴露于室溫。
四、控制反應(yīng)時間，避免過度代謝
反應(yīng)時間需根據(jù)底物代謝速率優(yōu)化，通常為5-60分鐘。時間過短，代謝產(chǎn)物不足；過長則可能導致產(chǎn)物進一步代謝或酶活性衰減。建議進行時間梯度實驗，確保代謝物生成呈線性增長。
五、及時終止，鎖定代謝狀態(tài)
反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)立即加入終止液（如乙腈、甲醇或含內(nèi)標的冷有機溶劑），使蛋白變性，終止酶促反應(yīng)。延遲終止會導致代謝持續(xù)，影響定量準確性。
六、注意種屬與批次差異
不同來源、不同批次的微粒體CYP酶表達水平可能存在差異，建議記錄供應(yīng)商、批號，并在關(guān)鍵實驗中使用經(jīng)過驗證的標準化產(chǎn)品。若需跨批次比較，應(yīng)進行平行對照。
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更新時間：2025-11-10
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